|
|
Random mutagenesis and selection of red yeast mutants capable to utilize particular waste substrates
Čačková, Katarína ; Breierová, Emília (referee) ; Márová, Ivana (advisor)
Carotenoids are naturally occurring pigments of plants also produced by microbes. The area of their application concerns mainly food industry; however, they are used in chemical, pharmaceutical, and cosmetics industry as well. Currently, the isolation of carotenoids from plants is markedly regulated by legislation, so the study of their production is greatly emphasised, where the microbiological, instead of the synthetic, production of carotenoids is being prioritized. This work was made as a comparative study of carotenogenic yeasts of the genes Rhodotorula, Sporobolomyces, and Cystofilobasidium. Their ability to use various waste substrates as a carbon and nitrogen source and source of other nutrition factors was tested. In this work, conditions of random mutagenesis were optimized. Particular yeast strains were also subjected to the effect of mutagen ethyl methanesulfonate (EMS) in order to increase the production of biomass and specific metabolites – carotenoids and other lipid-soluble substances. Random mutagenesis and mutant strain selection was performed using waste subtrates as glycerol, pasta and some pasta hydrolyzed by fungal extracellular enzymes. Subsequently, a control of specific DNA sequences in pigments overproducing mutants was analyzed by PCR/DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis). Increased production of -carotene was achieved in a mutant of Sporobolomyces roseus strain growing on glycerol, pasta, and hydrolyzed pasta. Overproduction of carotenoids by mutant strain of Rhodotorula glutinis was observed in glucose medium only. Mutants of Cystofilobasidium capitatum exhibited a decrease of biomass production; on the other hand, the production of carotenoids increased especially in pasta medium hydrolyzed by enzyme preparative from Fusarium solani. In this work it was confirmed that using random mutagenesis strains capable to utilize waste substrates can be selected. In mutant strains increased carotenoids biosynthesis was observed, which enables effective use of cheap substrates and reduction of the negative effects of wastes on the environment.
|
|
|
Controlled biotechnological production of polyhydroxyalkanoates
Šnajdar, Ondřej ; Pekař, Miloslav (referee) ; Obruča, Stanislav (advisor)
Předložená diplomová práce se zabývá produkcí polyhydroxyalkanoátů (PHA) bakterií Cupriavidus necator H16. Cílem práce byla příprava, selekce a charakterizace mutantních kmenů schopných vyšší produkce PHA. V teoretické části byla zpracována literární rešerše zabývající se nejdůležitějšími typy PHA, bakterií Cupriavidus necator a způsoby indukce mutageneze. V experimentální části byly připraveny mutantní kmeny pomocí fyzikální a chemické mutageneze. Mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA byly selektovány pomocí kultivace na minerálním médium s olejem. Pro další studium byly vybrány 4 mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA. Tyto mutantní kmeny byly dále podrobeny biochemické charakterizaci. Byly naměřeny specifické aktivity vybraných intracelulárních enzymů včetně enzymů podílejících se na biosyntéze PHA. Také byla naměřena resistence mutantů vůči oxidačnímu stresu. Bylo zjištěno, že mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA mají vyšší aktivity enzymů produkujících NADPH. NADPH je jeden z klíčových substrátů ovlivňujících směr toku acetyl-CoA metabolizmem. Vyšší intracelulární koncentrace NADPH parciálně inhibuje Krebsův cyklus a aktivuje akumulaci PHA. Aktivity acetoacetyl-CoA reduktázy a PHA syntázy, enzymů zapojených do syntézy PHA, těchto mutantů proto byly také vyšší stejně jako molekulová hmotnost připravených polymerů. Aplikace fyzikálních a chemických mutagenů je způsob, kterým lze připravit biotechnologicky perspektivní mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA.
|
|
|
Use of some molecular techniques to metabolic characterization of industrially significant yeasts
Kostovová, Iveta ; Brázda, Václav (referee) ; Kráčmar, Stanislav (referee) ; Márová, Ivana (advisor)
Karotenoidy, ergosterol a mastné kyseliny jsou velmi žádané látky využívané v krmivářském, potravinářském a kosmetickém průmyslu. Konvenční zdroje mastných kyselin a karotenoidů jsou závislé na sezónních podmínkách, geografické poloze a na dostupnosti zemědělské půdy, což znesnadňuje pokrýt jejich neustále se zvyšující spotřebu. Velmi slibným řešením je mikrobiální produkce výše uvedených látek pomocí karotenogenních kvasinek, které jsou schopny simultánně produkovat karotenoidy, mastné kyseliny i ergosterol. Předložená disertační práce je zaměřená na molekulární a metabolickou charakterizaci karotenogenních kvasinek a na jejich potenciál pro průmyslové aplikace. Proto první experimentální části práce jsou zaměřeny na kvasinky druhu R. mucilaginosa a R. toruloides, jejich produkční vlastnosti, vliv nutričního stresu a různých zdrojů uhlíku, jakými byly xylóza a glycerol. Kromě podrobné charakterizace jejich produkčních vlastností, byly tyto kmeny také charakterizovány molekulárními metodami, zahrnující sekvenční analýzu ITS1, ITS2 a D1/2 ribozomálního operonu a analýzu mini a mikrosatelitních sekvencí M13 a GTG5. Druh R. toruloides je známý jako vynikající producent mastných kyselin, a proto se v poslední době stal cílovou karotenogenní kvasinkou pro vývoj nástrojů pro jeho genetickou manipulaci. V této práci byly úspěšně připraveny geneticky modifikované klony kmene R. toruloides, nesoucí nadměrně exprimované geny pro diacylglycerol acyltransferázu (DGA1) a glycerol-3-fosfát dehydrogenázu (GPD1). Produkce mastných kyselin u modifikovaných klonů nebyla ve srovnání s původním kmenem vyšší. Proto byla další část práce zaměřená na přípravu nadprodukčních mutantních kmenů připravených náhodnou mutagenezí. Kombinace limitace dusíkem a inhibice produkce karotenoidů vedla k úspěšné selekci robustních mutantních kmenů s nadprodukcí karotenoidů vykazující rezistenci vůči difenylaminu. Poslední část práce se zabývá produkčními vlastnostmi méně známých druhů karotenogenních kvasinek náležící do řádů Sporidiobolales a Cystofilobasidales, ve srovnání s relativně dobře prostudovanými karotenogenními druhy R. toruloides a P.rhodozyma. V této studii byly nejlešími producenty mastných kyselin kmeny S.metaroseus CCY 19-6-20 a C. macerans CCY 10-01-02. Nejlepší producent karotenoidů, kmen R. mucilaginosa CCY 19-04-06, navíc produkoval lykopen, který představoval více než 80 % celkového množství karotenoidů produkovaných tímto kmenem.
|
|
|
Cloning, expression and characterization of human serine racemase mutants
Nováková, Ilona ; Konvalinka, Jan (advisor) ; Brynda, Jiří (referee)
AAbbssttrraacctt Human serine racemase (hSR) is a cytosolic pyridoxal-5'-phosphate dependent enzyme localized in the central nervous system. It synthesizes D-serine, which is an endogenous coagonist for the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors and plays a key role in excitatory neurotransmission in the brain. Thus, human serine racemase is a promising target for the treatment of neurodegenerative diseases connected with NMDA receptors. However, few specific inhibitors have been identified to date and the crystal structure of hSR has become available only very recently. We decided to perform a random mutagenesis to determine the amino acid residues critical for the enzyme activity. Ser 84 was reported as a catalytic residue along with Lys 56. After analysis of a double mutant S84G/P111L which retained its capability to convert L-serine to pyruvate, we prepared and characterized the single mutant S84G in order to exclude potential effect of the P111L mutation.on the activity of the analyzed enzyme. KKeeyy wwoorrddss:: D-serine; Serine racemase; PLP-dependent enzymes; Random mutagenesis; Racemases
|
|
|
Use of some molecular techniques to metabolic characterization of industrially significant yeasts
Kostovová, Iveta ; Brázda, Václav (referee) ; Kráčmar, Stanislav (referee) ; Márová, Ivana (advisor)
Karotenoidy, ergosterol a mastné kyseliny jsou velmi žádané látky využívané v krmivářském, potravinářském a kosmetickém průmyslu. Konvenční zdroje mastných kyselin a karotenoidů jsou závislé na sezónních podmínkách, geografické poloze a na dostupnosti zemědělské půdy, což znesnadňuje pokrýt jejich neustále se zvyšující spotřebu. Velmi slibným řešením je mikrobiální produkce výše uvedených látek pomocí karotenogenních kvasinek, které jsou schopny simultánně produkovat karotenoidy, mastné kyseliny i ergosterol. Předložená disertační práce je zaměřená na molekulární a metabolickou charakterizaci karotenogenních kvasinek a na jejich potenciál pro průmyslové aplikace. Proto první experimentální části práce jsou zaměřeny na kvasinky druhu R. mucilaginosa a R. toruloides, jejich produkční vlastnosti, vliv nutričního stresu a různých zdrojů uhlíku, jakými byly xylóza a glycerol. Kromě podrobné charakterizace jejich produkčních vlastností, byly tyto kmeny také charakterizovány molekulárními metodami, zahrnující sekvenční analýzu ITS1, ITS2 a D1/2 ribozomálního operonu a analýzu mini a mikrosatelitních sekvencí M13 a GTG5. Druh R. toruloides je známý jako vynikající producent mastných kyselin, a proto se v poslední době stal cílovou karotenogenní kvasinkou pro vývoj nástrojů pro jeho genetickou manipulaci. V této práci byly úspěšně připraveny geneticky modifikované klony kmene R. toruloides, nesoucí nadměrně exprimované geny pro diacylglycerol acyltransferázu (DGA1) a glycerol-3-fosfát dehydrogenázu (GPD1). Produkce mastných kyselin u modifikovaných klonů nebyla ve srovnání s původním kmenem vyšší. Proto byla další část práce zaměřená na přípravu nadprodukčních mutantních kmenů připravených náhodnou mutagenezí. Kombinace limitace dusíkem a inhibice produkce karotenoidů vedla k úspěšné selekci robustních mutantních kmenů s nadprodukcí karotenoidů vykazující rezistenci vůči difenylaminu. Poslední část práce se zabývá produkčními vlastnostmi méně známých druhů karotenogenních kvasinek náležící do řádů Sporidiobolales a Cystofilobasidales, ve srovnání s relativně dobře prostudovanými karotenogenními druhy R. toruloides a P.rhodozyma. V této studii byly nejlešími producenty mastných kyselin kmeny S.metaroseus CCY 19-6-20 a C. macerans CCY 10-01-02. Nejlepší producent karotenoidů, kmen R. mucilaginosa CCY 19-04-06, navíc produkoval lykopen, který představoval více než 80 % celkového množství karotenoidů produkovaných tímto kmenem.
|
|
|
Cloning, expression and characterization of human serine racemase mutants
Nováková, Ilona ; Brynda, Jiří (referee) ; Konvalinka, Jan (advisor)
AAbbssttrraacctt Human serine racemase (hSR) is a cytosolic pyridoxal-5'-phosphate dependent enzyme localized in the central nervous system. It synthesizes D-serine, which is an endogenous coagonist for the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors and plays a key role in excitatory neurotransmission in the brain. Thus, human serine racemase is a promising target for the treatment of neurodegenerative diseases connected with NMDA receptors. However, few specific inhibitors have been identified to date and the crystal structure of hSR has become available only very recently. We decided to perform a random mutagenesis to determine the amino acid residues critical for the enzyme activity. Ser 84 was reported as a catalytic residue along with Lys 56. After analysis of a double mutant S84G/P111L which retained its capability to convert L-serine to pyruvate, we prepared and characterized the single mutant S84G in order to exclude potential effect of the P111L mutation.on the activity of the analyzed enzyme. KKeeyy wwoorrddss:: D-serine; Serine racemase; PLP-dependent enzymes; Random mutagenesis; Racemases
|
|
|
Random mutagenesis and selection of red yeast mutants capable to utilize particular waste substrates
Čačková, Katarína ; Breierová, Emília (referee) ; Márová, Ivana (advisor)
Carotenoids are naturally occurring pigments of plants also produced by microbes. The area of their application concerns mainly food industry; however, they are used in chemical, pharmaceutical, and cosmetics industry as well. Currently, the isolation of carotenoids from plants is markedly regulated by legislation, so the study of their production is greatly emphasised, where the microbiological, instead of the synthetic, production of carotenoids is being prioritized. This work was made as a comparative study of carotenogenic yeasts of the genes Rhodotorula, Sporobolomyces, and Cystofilobasidium. Their ability to use various waste substrates as a carbon and nitrogen source and source of other nutrition factors was tested. In this work, conditions of random mutagenesis were optimized. Particular yeast strains were also subjected to the effect of mutagen ethyl methanesulfonate (EMS) in order to increase the production of biomass and specific metabolites – carotenoids and other lipid-soluble substances. Random mutagenesis and mutant strain selection was performed using waste subtrates as glycerol, pasta and some pasta hydrolyzed by fungal extracellular enzymes. Subsequently, a control of specific DNA sequences in pigments overproducing mutants was analyzed by PCR/DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis). Increased production of -carotene was achieved in a mutant of Sporobolomyces roseus strain growing on glycerol, pasta, and hydrolyzed pasta. Overproduction of carotenoids by mutant strain of Rhodotorula glutinis was observed in glucose medium only. Mutants of Cystofilobasidium capitatum exhibited a decrease of biomass production; on the other hand, the production of carotenoids increased especially in pasta medium hydrolyzed by enzyme preparative from Fusarium solani. In this work it was confirmed that using random mutagenesis strains capable to utilize waste substrates can be selected. In mutant strains increased carotenoids biosynthesis was observed, which enables effective use of cheap substrates and reduction of the negative effects of wastes on the environment.
|
|
|
Controlled biotechnological production of polyhydroxyalkanoates
Šnajdar, Ondřej ; Pekař, Miloslav (referee) ; Obruča, Stanislav (advisor)
Předložená diplomová práce se zabývá produkcí polyhydroxyalkanoátů (PHA) bakterií Cupriavidus necator H16. Cílem práce byla příprava, selekce a charakterizace mutantních kmenů schopných vyšší produkce PHA. V teoretické části byla zpracována literární rešerše zabývající se nejdůležitějšími typy PHA, bakterií Cupriavidus necator a způsoby indukce mutageneze. V experimentální části byly připraveny mutantní kmeny pomocí fyzikální a chemické mutageneze. Mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA byly selektovány pomocí kultivace na minerálním médium s olejem. Pro další studium byly vybrány 4 mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA. Tyto mutantní kmeny byly dále podrobeny biochemické charakterizaci. Byly naměřeny specifické aktivity vybraných intracelulárních enzymů včetně enzymů podílejících se na biosyntéze PHA. Také byla naměřena resistence mutantů vůči oxidačnímu stresu. Bylo zjištěno, že mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA mají vyšší aktivity enzymů produkujících NADPH. NADPH je jeden z klíčových substrátů ovlivňujících směr toku acetyl-CoA metabolizmem. Vyšší intracelulární koncentrace NADPH parciálně inhibuje Krebsův cyklus a aktivuje akumulaci PHA. Aktivity acetoacetyl-CoA reduktázy a PHA syntázy, enzymů zapojených do syntézy PHA, těchto mutantů proto byly také vyšší stejně jako molekulová hmotnost připravených polymerů. Aplikace fyzikálních a chemických mutagenů je způsob, kterým lze připravit biotechnologicky perspektivní mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA.
|
guest ::
